En las células se encuentran miles de proteínas. Todas están constituidas por secuencias de solamente 20 aminoácidos, aunque biológicamente tienen funciones extraordinariamente diferentes, químicamente son muy semejantes. Sin embargo, si un bioquímico está interesado en estudiar las características y función de una sola proteína lo más probable es que tenga que purificarla de todas las demás. Esto, hasta hace muy pocos años, constituía un reto muy grande, pues la separación y purificación de compuestos por los métodos químicos tradicionales implicaba metodologías para distinguir diferencias físicas y/o químicas entre una substancia y otra para poder separarlas. Los laboratorios actuales disponen de métodos muy poderosos para purificar una proteína en muy poco tiempo; anteriormente el tiempo requerido se medía en meses y hasta en años, ahora pueden ser días o semanas. El propósito de esta sección es estudiar algunos de los métodos más empleados para purificar proteínas.
El trabajo de purificación de un compuesto, que se encuentre dentro de un tejido u órgano, se inicia con algún método de maceración, para romper las células y dejar libre el contenido, suspendido en algún líquido (generalmente se usa un buffer). Esto se llama un homogenado. En el recipiente que contiene el homogenado están en solución todos los compuestos que se encuentran en esta forma en el citoplasma de la célula y suspendidos los organelos intracelulares tales como mitocondrias, lisosomas o núcleos y fragmentos de membranas. El homogenado es una mezcla muy compleja, por lo que el siguiente paso es hacer una separación parcial de sus componentes.
La centrifugación del homogenado (Fig. 5.3), permite separar de una forma bastante aceptable los componentes que lo constituyen. El principio de este procedimiento es el de aumentar la fuerza de la gravedad g, utilizando una centrífuga cuyo rotor gira a muchas revoluciones por minuto. Bajo estas condiciones, las partículas más pesadas se van al fondo del recipiente más rápidamente que las menos pesadas. En un homogenado sometido a las condiciones descritas, se pueden separar, por ejemplo, los núcleos de las mitocondrias, ya que los primeros son más pesados que las segundas, por lo que se va a obtener en el fondo del recipiente una fracción que consta de núcleos mientras que las mitocondrias van a permanecer en la suspensión. Si, en un segundo paso, se centrifuga la fracción que se ha separado de los núcleos a una velocidad mayor que la que se imprimió la primera vez, ahora son las mitocondrias las que van a precipitarse al fondo, quedando en suspensión sólo partículas más pequeñas que ellas, tales como ribosomas y fragmentos de membranas.
Después de varias centrifugaciones se tienen varias fracciones, las cuales pueden ser, o ricas en núcleos, o en mitocondrias, o ribosomas etc. Si, por ejemplo, la proteína que interesa estudiar está en las mitocondrias, se pueden descartar las otras fracciones y conservar únicamente la que es rica en estos organelos, para trabajar en pasos posteriores de purificación únicamente con esta parte. Las fracciones todavía son muy complejas por lo que respecta al número de moléculas diferentes que contienen, de tal manera que a este nivel todavía se está muy lejos de poder lograr la purificación de algún compuesto.
El siguiente paso es separar todas las proteínas de otras moléculas existentes en la mezcla, como por ejemplo metales, carbohidratos o lípidos. Un método consiste en el procedimiento de diálisis (Fig. 5.4).
En la diálisis se usa una bolsa que tenga poros lo suficientemente pequeños para impedir el paso de moléculas grandes (proteínas), pero lo bastante grandes, como para que las moléculas pequeñas puedan pasar a través de ellos. Dentro de la bolsa se coloca alguna fracción del homogenado y se cierra herméticamente. El sistema así construido se pone dentro de un recipiente con agua destilada, que se renueva continuamente. Bajo estas condiciones se tiene una diferencia de concentraciones, entre el líquido del interior de la bolsa y el agua destilada, y como se analizó en el Capítulo 2, va a existir una tendencia a igualar las concentraciones, por lo que las moléculas del interior van a tratar de salir hacia el agua destilada, pero como las moléculas de proteína no pueden pasar por los poros, solamente lo harán las moléculas pequeñas, el transporte de materiales seguirá hasta que se igualen las concentraciones en los dos compartimentos. Si el agua destilada se cambia continuamente, se evitará que se llegue al equilibrio, de tal manera que seguirán saliendo moléculas pequeñas. Si este proceso continúa, en el interior de la bolsa quedarán únicamente moléculas de proteína. Con este procedimiento se tiene ahora una mezcla de muchas proteínas; el siguiente paso es purificar la que se requiere.
Como las proteínas son moléculas con carga eléctrica y ésta varía de acuerdo al pH de la solución en la que se encuentran disueltas, un método muy usual para lograr su separación es mediante la técnica de electroforesis, descrita en el capítulo anterior, en relación con la separación de los aminoácidos.
Otra forma de separar proteínas con tamaños diferentes, es mediante la filtración en gel (Fig. 5.5). En este método se usa un gel hidrófilo, fabricado con un polímero, como por ejemplo el dextrán, que se coloca en un tubo. Este material tiene la propiedad de formar una malla molecular en la que los poros son muy pequeños. En un extremo del tubo se pipetea una solución que contenga la mezcla de proteínas. Las proteínas más pequeñas pueden pasar por los poros del gel y las más grandes no, de tal manera que del otro lado del tubo salen, en primer lugar, las proteínas grandes, las pequeñas se van a retardar debido a que tienen que atravesar toda la malla molecular. Si el líquido que está saliendo de la columna se colecta en diferentes recipientes, éstos llevan diferentes tipos de proteínas.
Combinando varios de los métodos que se describen aquí, junto con otros adicionales, es posible obtener en un tubo de ensaye una proteína totalmente pura. Habiendo logrado esto se está listo para estudiarla, en cuanto a su estructura y función.