La electroforesis es una técnica que permite separar aminoácidos a partir de mezclas de los mismos, se basa en el principio de la atracción de cargas eléctricas de signo contrario. Figura 4.9. En la sección anterior se analizó que los aminoácidos en determinados pHs tienen cargas eléctricas y por lo tanto son susceptibles de ser atraídos o repelidos por otros cuerpos con carga. Un aminoácido completamente protonado, como la forma A de la Fórmula 4.6, tiene una carga neta positiva, (+1). Si a una solución, que contenga el aminoácido en éstas condiciones, se le aplica corriente, las moléculas van a migrar hacia el polo negativo (cátodo). La molécula B, representada en la Fórmula 4.6, tiene tanto una carga positiva, como una negativa, o sea que su carga neta es de cero y no migra hacia ningún polo. Sin embargo la estructura C tiene una carga neta de –1 y por lo tanto al aplicarle corriente migra hacia el polo positivo o ánodo.
Es importante recalcar que la forma iónica en que se encuentra un aminoácido depende del valor de pH del medio en el que se encuentra disuelto y de su pK. Viendo la Tabla 4.1 se observa que los aminoácidos tienen diferentes pK y por lo tanto a un determinado pH es posible que dos aminoácidos que se encuentren mezclados tengan cargas diferentes y por lo tanto uno migra hacia el cátodo y el otro hacia el ánodo, con lo que se separa esta mezcla de aminoácidos.
Para tener una idea más clara de este método se presenta el siguiente ejemplo:
Suponer que se tiene una mezcla de alanina, ácido glutámico y lisina, la cual va a ser separada por el método de electroforesis. ¿Cómo se comporta esta solución en diferentes pHs? Para predecir lo que ocurre, hay que ver todas las formas iónicas posibles para cada aminoácido y tener presente los pKs. En el caso del ácido glutámico los datos se encuentran en 4.7. Las diferentes formas iónicas en las que puede existir la alanina son:
4.8
La lisina, por su parte, se disocia de la siguiente manera:
4.9
Con estos datos es posible analizar cómo se comportan estos tres aminoácidos a diferentes pHs:
1. pH = 1: A esta concentración de protones, el pH es menor que el pKCOOH de los tres aminoácidos y por lo tanto se encontrarían en las formas A, X y R, que se muestran en 4.7, 4.8 y 4.9, o sea en la forma más protonada posible y, por lo tanto, los tres aminoácidos tienen una carga de +1. Si a esta solución se le aplica una corriente eléctrica, las moléculas migran hacia el polo negativo, pero así no se logra su separación.
2. pH = 6: Para el ácido glutámico este valor está por arriba del pKR = 4.25, pero por debajo del pKNH2 = 9.67, por lo que se tiene prácticamente todo el glutamato en la forma C, según se ve en 4.7, de la sección anterior, o en el punto C de la figura 4.8, que se encuentra en la sección anterior. La molécula tiene dos cargas negativas y una positiva, es decir una carga neta de –1. Si se aplica corriente, esta molécula va a migrar hacia el polo positivo. En el caso de la alanina este valor de pH es mayor que su pKCOOH pero menor que su pKNH2 = 9.69 por lo que la alanina se encuentra en la forma Y que se representa en 4.8. Por lo tanto, la alanina tiene una carga positiva y otra negativa dándole una carga neta de cero y así, no se mueve bajo la influencia de un campo eléctrico. La lisina se encuentra en la forma S que se muestra en 4.9, teniendo dos cargas positivas y una negativa, lo que le da una carga neta de +1 y va a migrar hacia el polo negativo en un campo eléctrico.
3. pH = 13: En este medio tan alcalino el pH es superior a cualquier pK de los tres aminoácidos por lo que se encuentran en la forma menos protonada, D, Z y U que se muestran en 4.7, 4.8 y 4.9. El ácido glutámico tiene una carga neta de –2, la alanina de –1 y la lisina de –1 y todos migran hacia el cátodo. El glutámico se puede separar de los otros dos aminoácidos, ya que tiene una carga negativa extra y va a ser atraído más fuertemente por el polo positivo.
Mediante la electroforesis es posible separar mezclas complejas de los aminoácidos aplicando una corriente y haciendo variar el pH en incrementos muy pequeños.